一、研究背景

由脱细胞细胞外基质（dECM）组成的组织工程支架在许多应用中显示出支持再生的巨大能力。dECM通过其纤维蛋白、蛋白聚糖、生长因子、细胞因子和mRNA的复杂组成提供结构和生物学线索来引导组织重塑。细胞与dECM相互作用并吸收dECM，导致生物活性产物的释放，如具有化学吸引力的低分子量蛋白、血管生成生长因子和mRNA。组织特异性dECM通过支持细胞募集、增殖和组织特异性分化，成功地促进了血管生成、肌生成、神经发生和免疫调节行为。小肠粘膜下层（SIS）是市场上最突出的dECM支架之一，因为它含有高水平的生长因子和营养物质，以支持肠道内膜的持续再生。在临床试验中，SIS支架已成功再生气道、腹壁、隔膜、肠、膀胱、肩袖、皮肤和尿道组织。

将dECM制造成目标应用的专门结构仍然具有挑战性。蛋白质和生长因子的生物活性可以很容易地与酶消化，热暴露，或苛刻的溶剂失活。临床实践目前仅限于原生的dECM表格。dECM支架的宏观结构和微观形态受限于收获组织的结构，可能是片或管。目前扩大dECM支架应用的研究策略主要是探索水凝胶和结合装置，如涂层和复合材料。水凝胶提供了一个肿胀的基质，具有注入的潜力。然而，凝胶制备需要酶促消化来溶解ECM，这会使重要成分变性和失活，从而降低dECM的功能性生物活性。同样，dECM涂层和复合材料可以改善机械性能或结构，但它们含有可改变异物反应和组织重塑反应的替代材料。需要一种方法来生产具有保留生物活性的dECM支架，具有调节几何形状的能力，并且没有可能产生负面生物反应的添加剂材料。

静电纺丝是一种制造平台，可以控制宏观和微观结构，并可以按比例制造具有临床相关尺寸的网格。例如，电纺丝材料可以制造复杂的宏观结构，如阀门、接枝、敷料和包裹。此外，纤维微结构可以控制其各向异性、孔径和表面纹理。例如，纤维可以排列以支持骨骼肌等各向异性组织的再生，或者随机定向以支持脂肪组织等各向同性组织的再生。静电纺网的多孔性和高表面积也为细胞相互作用和渗透提供了一个可调节的平台。尽管静电纺丝在制造dECM支架方面表现出了高生物活性保留和多用途结构的前景，但在静电纺丝过程中使用聚合物添加剂来促进dECM纤维的形成仍然很常见。传统的静电纺丝需要聚合物链沿静电场排列的迁移性和链的缠结来承受静电力。聚合物添加剂增加了链缠结；然而，添加剂会对支架的生物反应产生负面影响。其他提高可纺性的方法利用酶解将ECM分解成单个链，这可以通过变性降低生物活性。与传统的消化和溶解的dECM纺丝溶液相比，我们最近的工作展示了一种新的悬浮静电纺丝方法，使用脱细胞骨骼肌。通过细胞附着、增殖和分化，所得到的支架保留了肌原性生物活性。静电纺丝ECM悬浮液，没有完全消化，有可能维持更高层次的蛋白质结构，这可以转化为ECM支架，具有更高的生物活性保留和更慢的吸收速率。控制和扩大ECM支架的吸收可以消除化学交联剂的需要，这些交联剂会损害重塑并诱导慢性异物反应。然而，dECM悬浮液的静电纺丝尚处于起步阶段，因此获得可纺丝悬浮液的关键流变参数尚未阐明。为了扩大电纺丝dECM支架在组织工程中的广泛应用，需要对其悬浮性能及其纤维形成能力进行严格的评估。

在本研究中，确定了促进静电纺丝或灌输“可纺性”所需的dECM悬浮液的关键特性。我们对各种不同均质水平、浓度和地面粒径的dECM悬浮液进行了严格的流变学评估。通过静电纺丝不同的ECM组合物，或用不同的脱细胞技术或组织来源制备，展示了dECM悬浮静电纺丝方法的多功能性。然后通过细胞增殖、巨噬细胞极化和血管生成来评估生物活性保留水平。这项对静电纺丝dECM关键参数的评估旨在为研究小组提供一个可访问的工具箱，以创建具有高生物活性保留的专门dECM支架，用于许多组织再生应用。

二、摘要

脱细胞细胞外基质（dECM）作为组织工程支架具有很强的再生潜力；然而，目前临床对dECM支架的选择仅限于将其原生形态冷冻干燥成片状。静电纺丝是一种多用途的支架制造技术，可以控制宏观和微观结构。电自旋dECM仍然具有挑战性，这使得研究人员要么将其与合成材料混合，要么使用酶消化来完全溶解dECM。这两种策略都降低了dECM的先天生物活性，限制了其再生潜力。在此，我们开发了一种新的悬浮静电纺丝方法来制造纯dECM纤维网，并保留其固有的生物活性。系统地研究了悬浮液参数，以确定注入“可纺性”所需的关键流变性能，包括均质性、浓度和粒度。均质化增强粒子相互作用，赋予必要的弹性行为，以承受静电拉伸而不破裂。观察到浓度与粘度之间存在直接的相关关系；而粒径对悬浮性能和纤维形态的影响最小。通过三种常见脱细胞技术（Abraham, Badylak, Luo）和组织来源（肠粘膜下层，心脏，皮肤）的电纺丝dECM证明了这种新方法的多功能性。通过细胞增殖、血管生成和巨噬细胞极化实验证实了静电纺丝后的生物活性保留。总的来说，这些发现为研究人员提供了一个框架，以电自旋dECM用于各种组织工程应用。

三、结论

在这项研究中，我们对静电纺丝过程中支持纤维形成所需的dECM悬浮性能进行了严格的评估。均质化是提高dECM悬浮液颗粒相互作用和弹性行为的一种机制。损耗和储存模量曲线的交叉应变幅大于100%被确定为可纺dECM悬浮液的功能流变预测因子。纤维形态对悬浮液浓度的敏感性与静电纺丝过程中聚合物溶液浓度的变化趋势相似。有趣的是，纤维形态和纺丝相对独立于干燥的颗粒大小，因为悬浮颗粒分解到一致的状态。通过利用三种不同的脱细胞和制备技术以及三种不同成分的dECM组织来源，展示了这种dECM悬浮静电纺丝方法的多功能性，这表明了从迄今为止已被分解为粉末的组织来源制造ECM支架的潜力，并模拟了目标器官系统的天然ECM组成。这些基团显示出相似的可纺性流变预测因子；即在100%以上的交叉应变幅值。这些研究说明了每个dECM制备步骤对纤维收集的影响，因此该方案可以很容易地适用于特定的组织来源和应用。我们开发这种新型悬浮静电纺丝方法的主要目标是增加加工后网状物的生物活性保留，这是目前使用合成聚合物混合物或酶消化的dECM纺丝方法的主要限制。在细胞增殖、血管生成和免疫调节方面，这些静电纺丝SIS网的再生能力与去细胞化SIS片的对照相似。总的来说，本研究阐明了指导dECM悬浮静电纺丝的关键参数，为研究人员提供了一个框架，可以使用这种新方法来制造保留其天然再生能力的dECM支架。

图1.dECM静电纺丝法原理图。A)制备dECM静电纺丝悬浮液需要五个步骤，包括脱细胞、均质、研磨、HFIP悬浮和第二轮均质。步骤1-5的微距图像；比例尺= 1厘米。插入步骤3干燥SIS颗粒的SEM图像；标尺= 300 μm。在步骤4中插入悬浮SIS粒子的明场图像；标尺= 60 μm。B)通过在流动的悬浮液和集电极之间施加电场，使dECM悬浮液静电旋转。在BioRender中创建的图形。电纺dECM纤维的SEM图像；标尺= 30 μm。

图2.均质化对悬浮粒子形态、流变性能和纤维收集的影响。A)静电纺丝悬浮液中dECM粒子的明场图像。标尺= 60 μm。B)收集形态的SEM图像。标尺= 20 μm。C) dECM悬浮液的应变振幅扫描，其中实心点以下降振幅扫描方式收集，空心点以上升方式收集。灰色虚线表示振幅下降试验的交叉，黑色虚线表示施加应变上升的交叉。D)用下降和上升的应变扫描收集存储模量和损耗模量交叉时的应变幅值。E) dECM悬浮液粘度的速率依赖性。