一、研究背景

骨缺损的修复和治疗仍然具有挑战性。传统的骨组织修复方法包括自体骨移植、异体骨移植和骨水泥填充，但每种方法都有其不足之处。目前，随着组织工程技术的发展，生物相容性好、细胞毒性低、骨诱导能力强的组织工程支架在骨修复研究中得到越来越多的应用。

目前，骨再生常用的支架制造方法有热诱导相分离、真空干燥、3D打印、利用静电纺丝设备等。熔融电写（MEW）是一种新兴的3D打印技术，可以精确沉积具有预设图案的纤维，以生产具有3D结构的高度有序微米级支架，，已广泛用于制造组织工程支架。与传统的挤压3D打印技术（如熔丝沉积建模（FDM））相比，通过MEW制造的支架由于电场的拉伸而提供了更高的分辨率。因此，MEW支架具有更小的纤维直径，更大的孔隙率，并且更接近细胞外基质（ECM）的尺寸，从而显示出对细胞生长和组织工程的促进作用。与水凝胶和纳米纤维相比，MEW支架除了具有精确可控的纤维堆叠外，还具有更好的力学性能，可在骨缺损区域提供更强的机械支撑。MEW支架在骨组织工程中的应用和优势已经得到了广泛的研究。Abbasi等人证明，具有明确孔隙结构的MEW支架可以支持高度的细胞增殖和成骨细胞的浸润。Xiong等人通过模拟天然骨-韧带界面制备了MEW仿生网格卷曲纤维模式，验证了MEW晶格结构具有优异的成骨诱导能力。尽管MEW支架具有诸多优点，但在骨修复方面仍存在一些不足。首先，与纳米级细胞外基质（ECM）相比，MEW生产的大多数纤维都在几微米到几十微米之间。其次，虽然聚（ε-己内酯）（PCL）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）等常用的合成材料具有良好的生物相容性、可加工性和力学性能，但其较差的生物活性和疏水性不利于细胞粘附和生长。溶液静电纺丝（SES）是一种利用远场静电力制备纳米纤维的技术。由SES生产的纳米纤维具有几个有利的特性，包括大孔隙率、高比表面积和与天然ECM相似的形态，这些特性已被广泛用于促进组织修复和再生。鉴于成骨细胞是锚定依赖性细胞，纳米纤维的上述特性可以增强成骨细胞的粘附和迁移。此外，已经证明SES适用于200多种聚合物，还可以在聚合物溶液中添加其他物质以实现特殊功能。Chakraborty等人发现再生纤维素纳米纤维支架具有良好的力学和化学性能，有利于成骨细胞的粘附和增殖。 Suryavanshi等人利用SES法制备了负载氧化镁纳米颗粒（MgO NP）的PCL骨-软组织工程支架，并证明该支架具有更好的力学性能和体外生物学性能。尽管大量研究表明纳米纤维有利于成骨细胞的粘附和增殖，但由于纳米纤维的加工方法难以制造出具有足够高度和孔隙度的三维结构支架，这限制了细胞向内生长和骨缺损再生。同时，SES纳米纤维的力学性能相对较弱，阻碍了其在骨组织工程中的应用。

研究表明，微纳米复合支架的微结构和纳米结构通过激活成骨细胞的多种受体，促进成骨分化和骨再生。MEW微纤维支架与SES纳米纤维的结合可以提供机械支撑和有利于细胞生长的微环境。该解决方案克服了两者的缺点，同时利用了它们的优点。之前，我们将MEW和SES结合成功制备了含有PCL微纤维网格和明胶纳米纤维的复合支架，表明微观结构和纳米纤维可以协同提高骨修复效果。

除了结构的影响外，支架的组成对骨修复的效果也至关重要。羟基磷灰石（HAP）是人类和动物骨骼的主要无机成分，由于其显著的生物活性、可降解性和骨导电性，近几十年来被广泛应用于牙科、抗肿瘤药物输送和骨修复。例如，Sadeghianmaryan等人证明，在3D打印的壳聚糖/海藻酸盐支架中添加HAP可以改善软骨细胞的增殖。此外，在提高骨形成能力的同时，骨组织工程支架还需要抵抗植入引起的细菌感染，避免对修复的骨组织造成二次损伤。抗生素是临床上最常用的骨感染预防手段。目前的研究表明，局部抗生素治疗可以提高药物的生物利用度，减轻后续药物干预的不良反应。因此，在骨组织工程支架中加载抗生素是避免骨感染的有利手段。骨感染通常是由葡萄球菌属的病原体引起的，尤其是金黄色葡萄球菌。罗红霉素（Roxithromycin， ROX）是一种大环内酯类抗生素，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及部分厌氧菌均有良好的抗菌作用。之前，我们成功制备了含有ROX的MEW PCL支架，该支架已被证明有利于预防和治疗骨感染。

本研究开发了一种由rox封装的MEW微纤维网格和HAP负载的SES纳米纤维组成的微纳米复合抗菌/成骨骨组织工程支架。采用扫描电镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、吸水性测定和力学分析等方法评价复合支架的理化特性。采用体外释放试验和抗菌试验对复合支架的ROX释放行为和抗菌活性进行表征。研究了复合支架对成骨细胞行为的影响。最后，将复合支架植入大鼠颅骨缺损模型，在体内评估其骨修复能力。

二、摘要

与单个纳米或微米大小的支架相比，微纳米复合支架在骨修复方面的优势已被广泛证实。然而，如何提高这些复合支架的生物活性仍是一项挑战。在本研究中，我们提出了一种结合熔融电泳（MEW）和溶液电纺（SES）技术的新方法，用于制造一种含有羟基磷灰石（HAP）（一种成骨成分）和罗红霉素（ROX）（一种抗菌活性成分）的复合支架。扫描电子显微镜（SEM）和傅立叶变换红外光谱（FTIR）证实了支架内纳米纤维-微网格的分层结构，以及 HAP 和 ROX 的成功负载。HAP 的加入增强了复合支架的吸水能力，从而促进了细胞的粘附和增殖以及成骨分化。此外，ROX 还具有有效的抗菌能力，且无明显的细胞毒性。最后，将支架应用于大鼠腓骨缺损模型，结果表明，20% HAP 组的新骨形成效果更佳，且不会引起不良反应。因此，我们的研究结果为设计和制造用于骨再生的生物活性支架提供了一种前景广阔的策略。

三、结论

本研究成功制备了由ROX包封的MEW微纤维网格和hap负载的SES纳米纤维组成的微纳米复合抗菌-成骨骨组织工程支架。负载rox的微纤维网格具有机械强度和抗菌活性，而负载hap的纳米纤维可以模拟ECM，促进成骨细胞的粘附、增殖和成骨分化。吸水率测试证明HAP的加入提高了复合支架的亲水性。复合支架中的ROX表现出最初的爆发性释放和随后的延长释放行为。此外，复合支架在抗菌实验中表现出明显的抗菌活性，特别是对革兰氏阳性细菌。复合支架也被证明具有良好的细胞相容性，HAP的加入可以进一步促进成骨细胞的粘附和增殖。ALP活性、ARS染色、RT-qPCR均显示复合支架明显促进成骨，其中20% HAP组成骨活性最好。最后，体内骨修复实验表明，20% HAP组显著提高大鼠颅骨缺损修复水平，无不良反应。因此，MEW和SES制备的双功能微纳米复合支架具有相当大的骨组织工程应用潜力。

图1.PCL/ROX/HAP 微纳米复合材料支架的制作（A）和应用（B）示意图。

图2.(A)细胞在复合支架上培养24小时的活/死染色图像。(B)细胞在复合支架上培养第1、2、3天的CCK-8分析。(C)复合支架上细胞培养48h后的免疫染色图像。细胞骨架用Phalloidin染色为橙色，细胞核用DAPI染色为蓝色。**与对照组比较p < 0.01，与PCL组比较&&p < 0.01。

图3.新骨形成的组织学评价。(A)术后4周和12周颅骨缺损区H&E染色。(B)术后4周和12周颅骨缺损区马松三色染色。