一、研究背景

心血管疾病是目前全球死亡的主要原因。仅在美国，每年就有近 25 万例针对外周和冠状动脉病变的开放性血管重建手术。预计到 2030 年，将有近 2330 万人死于冠心病和心脏病发作。虽然原生静脉和动脉切片仍是通过外周冠状动脉搭桥术修复缺损血管的最佳方法，但当自体血管闭塞或病变，或其大小与缺损侧不一致时，其可用性就会受到限制。30%的患者无法获得合适的原生静脉，因此，使用生物相容性生物材料的人工血管移植物需求量很大。设计多层血管支架被认为是模拟原生血管结构和功能的有效方法。其中，电纺丝是获得血管支架的有效方法之一，因为通过混合各种材料和构建非分层层更容易开发多层支架。静电纺丝设备利用高压静电场生成纤维结构，提供类似于原生血管细胞外基质（ECM）的生物仿真细胞环境。电纺丝可制造纳米到微米尺度的纤维基质，并控制支架的成分、结构和生物力学特性。该技术可利用各种天然聚合物（如胶原蛋白和纤维蛋白）以及各种合成聚合物（如聚ε-己内酯（PCL）、聚（L-内酯）（PLLA）和聚（D-内酯）（PDLA），此外还有共聚物聚（L-内酯己内酯）（P(LLA-CL) 和聚（D,L-内酯-共聚乙二醇）（PLGA）。

胶原蛋白等天然聚合物源于生物，非常适合各种体内应用。它通过模拟原生 ECM 的关键机械生物学和生物化学特征，促进细胞粘附和生长。然而，大多数市售的胶原蛋白都取自动物产品，如肌腱、皮肤和骨骼，这让人对其质量、纯度、疾病传播和过敏反应产生担忧。另外，分子生物学和基因工程的发展使研究人员能够生产出可靠的、化学定义明确的重组人胶原蛋白肽（RHC），且不会引起过敏。例如，根据 III 型人胶原蛋白的 mRNA 序列，设计并合成了密码子优化的重组人胶原蛋白多肽单体基因。然后，将表达载体（pPIC9KG6）转化到 Pichia pastoris 中。随后，从转化子中筛选出高水平表达菌株进行高细胞密度发酵。在我们之前的研究中，基于 RHC 的生物材料已被开发成多孔支架和水凝胶。因此，我们选择 RHC 作为制备纳米纤维的生物材料。然而，仅用胶原蛋白制备的支架通常粘弹性较差，分解速度快，未交联时降解速度快且机械性能不稳定。另一方面，PCL 的降解速度较慢、成本较低、具有独特的流变和粘弹特性。此外，它还是一种公认的用于特定长期植入的模型生物材料。因此，本研究采用纳米纤维尺度制作了含有 RHC 和 PCL 的复合支架。

在模拟自体移植物时，需要具有接近原生血管机械和结构特性的支架。血管有三个不同的层次：内膜、中膜和外膜，它们将血液、氧气和营养物质输送到重要的组织和器官。内膜由一层内皮细胞组成，衬于血管内表面，起着吸收性生物聚合物膜的作用。内皮细胞分泌可溶性因子，以维持止血和血管壁的抗血栓形成特性。中膜和外膜包含平滑肌细胞和成纤维细胞，具有明显的周向取向，以提供承受循环系统高压所需的机械强度。因此，理想的血管移植物管状支架可能是由纳米纤维膜作为内层、具有较大孔隙的多孔层作为外层组成的双层移植物。不同的研究小组已尝试制造双层和多层移植物。

电纺丝制造的移植物通常孔隙较小，孔隙率较低，这两种情况都限制了细胞的浸润。已有许多技术被用于改善孔径，如利用盐、低温电纺、增加溶液浓度、使用痕化聚合物或带气体发泡的电纺等。在本研究中，为了制作多孔外层，在共电纺工艺中使用了牺牲纤维。聚环氧乙烷（PEO）具有高水溶性和足够的粘度，是形成牺牲纤维的最佳候选材料之一。Baker 等人首次引入了这种 PCL 和 PEO 纤维的组合，通过将 PEO 纤维溶解在水中来牺牲 PEO 纤维，从而生产出具有大孔隙且纤维缠结减少的 PCL 支架。

在本研究中，我们假设可以通过洗掉 PEO 纤维来扩大血管外壁的孔隙，以适应大鼠平滑肌细胞（A7r5）的浸润，同时在管腔附近保留一层直径较小的纤维，以促进连续的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）层的粘附。

二、摘要

心血管疾病，包括冠状动脉和外周血管病变，是导致死亡的主要原因。为了降低死亡率，人们开发了人工血管移植物来替代自体移植物。本研究介绍了具有适当结构和生物相容性的双层血管移植物的开发和表征。研究采用重组人胶原蛋白（RHC）肽和聚己内酯（PCL）的聚合物混合物，通过电纺丝构建移植物的内层，并将水溶性聚氧化乙烯（PEO）作为牺牲材料与 PCL 共同电纺丝生成多孔外层。力学测试表明，与原生血管结构相比，双层支架具有适当的力学性能。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在纳米纤维上播种后，与管腔的粘附性得到了增强。同时，通过去除 PEO 纤维来提高微纤维外层的孔隙率，大鼠平滑肌细胞（A7r5）可以增殖并轻松渗入多孔层。

三、结论

为了模拟原生血管的多层形态，我们利用静电纺丝设备 RHC 和 PCL 的方法，开发出了一种具有纤维内层和多孔外层的双层支架。内纤维层是通过电纺丝 PCL/RHC（2:1）聚合物溶液制成的，可使 HUVEC 黏附到管腔表面。此外，PCL 和 PEO 溶液与牺牲的 PEO 纤维共同电纺丝制成了预定义的多孔外层，可使 A7r5 均匀渗入该层。结果表明，这种支架具有生物相容性、可生物降解、易于制造，并能支持细胞粘附和浸润。此外，双层支架还具有足够的机械性能，能承受生理相关的血管条件。因此，它为进一步的体内研究提供了一种可行的方法，以全面评估这种支架作为潜在人造血管的性能和机械特性。

图1.双层支架的制造过程示意图：内层的制备（A），支架外层的共电纺（B），去除 PEO 纤维（C）。

 

图2.支架横向（A1）和横截面（A2）的数字图像。双层支架横截面的扫描电镜图像（B1）和两层之间界面的高倍放大图像（B2）。不同比例的电纺内层（PCL/RHC）：(C1) (2:1)、(C2) (1:1)、(C3) (1:2) 和 (C4) (1:0)，以及外层（PCL/PEO）（D1）：洗去 PEO 之前和（D2）：洗去 PEO 之后的 SEM 图像。