一、研究背景

在天然宏观材料中，蛛丝是具有优良生物相容性和机械性能的主要材料之一。早在古希腊时期，就有人们利用蜘蛛丝止血和愈合伤口的记载。由于蜘蛛丝具有细胞粘附性能，已被应用于促进体外细胞培养的活力和存活率。由于蜘蛛丝是由蜘蛛丝蛋白（spidroin）组成，其潜在的功能化蛋白质基因使其在细胞特异性粘附方面具有天然优势。同时，蜘蛛丝具有良好的水蒸气渗透性，使其更接近天然皮肤组织，为细胞提供更仿生的生理环境，从而有利于诱导组织再生。在蛋白质成型的众多方法中，纤维是最受关注的技术之一。 基于电纺丝的生物分子纤维可以实现细胞定向迁移和修复，促进伤口愈合，因此利用静电纺丝设备是制备蜘蛛丝纤维的有效手段。然而，由于蜘蛛的特殊性，很难大规模获得天然蛛丝，许多人致力于制造人工蛛丝，主要是通过异源表达重组蛛丝蛋白，然后在人工纺丝装置中纺丝。然而，天然蜘蛛丝基因的高 GC 含量、重复核心区的高重复氨基酸序列、高特异性氨基酸含量和高分子量对其高效异源表达构成了巨大挑战，这限制了蜘蛛丝的广泛应用，也限制了基于电纺丝技术制备重组蜘蛛丝的能力。因此，迫切需要更有效地异源表达主要安普拉蛛丝蛋白（MaSp）的策略。

过去二十年来，人们开发了许多策略来提高 MaSp 的异源表达效率。其中一种方法是设计一种由端部结构域和中央重复区域组成的迷你螺线管蛋白，与天然螺线管蛋白模板相比，该模板大大缩短。值得注意的是，在低浓度下（至少需要 50% w/v 才能成丝），迷你蜘蛛蛋白的成丝能力明显降低，这间接降低了其高产量的吸引力。为了提高成丝能力，用淀粉样多肽取代了 MaSp 中心重复区的丙氨酸基团，并增加了 MaSp 中心重复区的数量，从而获得了超高分子量的重组蜘蛛蛋白。然后用有机溶剂对获得的不溶性聚集体进行溶解和纺丝。这种方法可以将表达的大蜘蛛蛋白纺成具有高拉伸强度的纤维，但蛋白产量远远达不到工业化生产的要求。通过适当增加迷你蜘蛛蛋白所需的氨基肽置换中心重复区的数量，可以在成丝性能和异源表达效率之间取得相对平衡，实现高性能重组蜘蛛蛋白的批量生产。

二、摘要

蜘蛛丝蛋白（spidroin）独特的三维结构决定了spidroin纤维优异的机械性能，但重组蜘蛛丝蛋白异源表达困难、纺丝性能差等问题限制了其应用。通过序列修饰获得了一种高产低分子量的仿生物蜘蛛丝蛋白（Amy-6rep），并利用静电纺丝设备将其用作纳米发电机验证了其优异的纺丝性能。Amy-6rep 增加了天然 spidroin 核心重复区中高度纤维化的微晶区，序列长度有限，并通过结构相似性用淀粉样多肽取代了多聚丙氨酸序列。由于序列的修饰，Amy-6rep 的表达量增加了≈200%，Amy-6rep 的自组装性能也显著提高。用Amy-6rep进行电纺丝后，纳米纤维表现出良好的摩擦发电能力。本文报告了一种具有高产率和良好纺丝性能的仿生物纺丝素序列设计，并探讨了电纺丝生产人工纳米发电机的策略。

三、结论

在此，我们根据β折叠晶体结构的相似性，将低分子量螺旋藻素策略与淀粉样多肽置换的序列修饰策略相结合，提出了理想的微晶区数量，将天然螺旋藻素核心重复区的高纤维化微晶区数量增加到6个，并限制了序列长度。最后，通过构建大肠杆菌异源表达载体，获得了产量高、分子量低的仿生螺旋藻素。由于仿生蜘蛛蛋白中淀粉样多肽的序列重复率低，仿生蜘蛛蛋白Amy-6rep的异源表达产率提高了≈200%，为后续的大规模纺丝奠定了基础。事实证明，合理增加微晶区的数量可以提高仿生螺旋藻蛋白的自组装性能，但对异源表达水平没有显著影响。值得注意的是，我们对以沉淀形式表达的仿生蜘蛛蛋白采用了一种简单的包涵体洗涤方法，结果表明这种纯化方法的回收率达到了≈80%，与之前的Ni-NTA纯化方法相比，回收效率显著提高，间接提高了仿生蜘蛛蛋白的产量。

图1.以低分子量生物仿生蜘蛛蛋白电纺丝为原料，生物合成并生产纳米级生物仿生蜘蛛丝。由于序列长度有限，天然蜘蛛丝蛋白 MaSp1 的聚丙氨酸（polyAla）结构被缩短，并增加了微晶区的数量，以降低异源表达的难度。在此基础上，用具有交叉β-棘结构的淀粉样多肽序列取代了多丙氨酸特征基序，进一步降低了表达难度，并提高了所得蛋白质的机械性能。从工程菌中生物合成了仿生蜘蛛丝，并将其纯化为纺丝膏。通过高压电纺丝获得了具有三发电性能的仿生纳米蜘蛛丝，并利用这一特性制备了纳米发电机。

 

图2.a) 拟生物刺桐素的固体粉末。 i) 拟生物刺桐素在不同溶液中的溶解状态。从左到右依次为：1 毫克仿生物刺链蛋白溶于 1 毫升纯水；100 毫克仿生物刺链蛋白溶于 500 微升 HFIP；1 毫克背景大肠杆菌蛋白溶于 1 毫升 HFIP (ii)。b) 通过电纺丝获得的纳米磷脂纤维的扫描电镜图像（iii）和（iv）。 c) 纳米磷脂纤维膜的物理图像（v）；纳米磷脂纤维摩擦发电示意图（vi）和（vii）。示波器记录摩擦纳米磷纤维膜产生的电动势（viii）。在缓慢和快速的手部摩擦下，纳米空间纤维为一个 50 nF 的电容器充电（ix）。纳米石墨烯纤维摩擦产生的电能点亮 LED 灯（x）。比例尺： 5 毫米 (i)、20 微米 (iii)、2 微米 (iv)、1 厘米 (v)、2 厘米 (viii)。